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匠心医疗 只为优美生涯
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自从以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑手艺被发明以来 ，有一个词就像幽灵般盘旋在这个领域中 ，那就是“脱靶”。人人都讨论它 ，人人都畏惧它 ，但却没人看获得它。
然而在昨天 ，这个幽灵终于被人捉住了 ，中科院神经所杨辉实验室团队与合作者开发了一套名为GOTI的新手艺 ，让基因编辑的脱靶以后无所遁形 ，相关论文揭晓在3月1日的《科学》（Science）上['1']。
GOTI新手艺让基因编辑的脱靶以后无所遁形。
一枪打在了别人的靶子上
在2004年雅典奥运会男子50米步枪三姿决赛中 ，美国选手埃蒙斯遥遥领先 ，到了要打最后一枪的时间 ，他已然遥遥领先第二名整整三环。胜卷在握的他屏息凝思开了这一枪 ，又一次把子弹准确送到了差未几是靶心的位置 ，然而他的记分牌上却显示出一个匪夷所思的效果：
脱靶。
原来埃蒙斯犯了一个莫名其妙的过失——他最后一枪打在了别人的靶子上。
埃蒙斯：我怎么会……图片泉源：GETTY IMAGES埃蒙斯：我怎么会……图片泉源：GETTY IMAGES
奥运会的顶尖选手云云 ，生命科学的顶尖手艺亦是云云。
近年来很火的手艺“基因编辑” ，就有这个问题。只管以CRISPR/Cas9等为代表的新一代基因编辑以准确著称 ，但它们时时时就是会犯这种“打到别人靶子上”的误差——我们原来要让它去编辑A基因 ，但它却意外搞坏了B基因。
基因编辑的脱靶和奥运选手的脱靶一样都是极小概率的事务 ，但常在河滨走哪能不见鬼 ，每一次基因编辑操作 ，实质上都是成千上万的基因编辑工具对着成千上万的细胞做了成千上万次编辑 ，焉能包管次次不失手呢？
奥运选手脱靶最多丢块金牌 ，基因编辑脱靶了 ，丢的没准就是性命了。然而基因编辑手艺宛如一辆势不可挡的战车 ，正以排山倒海之势向着临床领域疾驰而来。
然而这历史的车轮真的不可挡吗？又该不应挡一下呢？
查明脱靶率可没那么容易
照旧拿奥运会打个例如吧 ，虽然奥运选手脱靶是个小概率事务 ，可是只要视察的次数足够多 ，就能够统计出他平均中靶几多次会泛起一次脱靶 ，这个就是就叫做“脱靶率”。
知道了脱靶率 ，我们才华制订一个标准。好比说划定平均一万枪内不可泛起凌驾一次脱靶 ，张三脱靶率是千分之一 ，那他就缺乏格；李四脱靶率万万分之一 ，那他就值得信任。
然而颇显尴尬的是 ，这么多年来 ，无论是支持基因编辑脱靶照旧阻挡基因编辑脱靶 ，各人很洪流平都只凭着一种“信仰” ，却历来没有人真正弄清过基因编辑的脱靶率究竟是几多。
这是由于 ，基因编辑的脱靶率真的太难检测了。
射击运发动的脱靶率可以直接“数”出来 ，基因编辑的脱靶率该怎样盘算呢？也许有人会说 ，这很简朴呀 ，把一批样天职成两组 ，一组做基因编辑 ，一组不做 ，然后比对一下两组的基因差别不就成了么？
2017年 ， Bassuk等几位科学家还真就这么干了['2'] ，他们用CRISPR/Cas9手艺编辑了几枚小鼠的受精卵 ，等这些受精卵发育成小鼠出生后检测了它们的基因 ，并将其与统一品系的其它小鼠作比照 ，效果居然发明了“一千多处难以预料的基因突变”。
只管这个效果立马成磷器大媒体的头条 ，但它却受到了学术圈内一致的口诛笔伐 ，由于这个检测犯了一个很初级的过失：天下上没有两只基因完全一样的小鼠。Bassuk的实验无法区分比对出来的基因差别事实来自于基因编辑 ，照旧小鼠之间原来就有的个体差别。
在一片指责声中 ，来自中科院神经科学研究所杨辉实验室的博士后左二伟（还记得吗？就是谁人敲染色体的 CRISPR又有新用场了！这或许是唐氏综合征患者的福音 ）却萌生了一个清奇的想法 ，其时他一拍大腿说 ，艾玛好机会啊 ，只要连忙用很是严谨的科学要领重做一下论文的事情 ，然后得出否定的结论批驳它 ，不就白捡一篇Nature methods嘛。
做着做着 ，他就发明 ，这个“很是严谨的科学要领”着实并不简朴（不然早几年全天下的科学家不就早该做了么）。更惨的是 ，他的事情铺开没过多久 ，Bassuk的论文就被撤稿了（详情请见：震惊！国际顶尖期刊宣布CRISPR有毒！震惊again！它又撤稿了�。�。
不过 ，左二伟博士照旧决议研究下这个问题 ，天下上不是有一句魔咒叫做“来都来了”嘛 ，顺便做做看吧……
经由与导师的讨论 ，一个可以精准检测脱靶的计划还真的逐步成型了。然而正是在左二伟博士“顺便”研究脱靶问题的这段时间里 ，基因编辑临床化的脚步却在日益加速。
2018年1月 ，美国批准了宾州大学一项使用CRISPR/Cas9修复免疫缺陷的临床试验。
2018年8月 ，欧洲多个国家批准了张锋的CRISPR Therapeutics公司的用CRISPR/Cas9治疗β地中海血虚症的临床试验。
2018年11月 ，解放军总医院的基于基因编辑T细胞治疗癌症的临床试验申请也被通过。
更遑论2018年11月份 ，原南方科技大学副教授贺建奎果真宣布自己做出了人类首例基因编辑婴儿。细思极恐的是 ，贺建奎之后 ，居然尚有不少力挺他的声音 ，其中不乏国际最顶尖的科学家。
张锋和David Liu等等也是极大地加速了基因编辑临床化的速率。
事实 ，谁第一个取得了临床化基因编辑的突破 ，谁就率先攻克了一块医疗的制高点 ，这其中的利益真的太诱人了。以致一时之间万马奔腾 ，有些人似乎已经不在乎这着实照旧一项危害未知的手艺了。
突然之间 ，左二伟博士以致整个杨辉实验室都似乎无意中站在了历史的节点上 ，这个随手做做的课题突然将会变得足以决议这个领域的历史走向——
检测出来若是证实基因编辑不易脱靶虽然皆大欢喜 ，但若是证实它容易脱靶呢？且不说杨辉自己实验室里那些涉及基因编辑向临床转化的课题将面临磨练 ，还可能由此在行业内掀起一园地动。
最终 ，左二伟博士在与导师杨辉研究员以及所长蒲慕明等人商议后 ，各人照旧决议继续做下去 ，事实……
得有人站出来肩负这个责任呀。
检测脱靶 ，阻碍重重
阻碍检测脱靶率的 ，除了“个体差别”外 ，尚有另一个障碍。
什么障碍呢？我们继续用射击做例如：能得分的目的靶子通常是唯一的 ，而目的外的“别人家的靶子”可就是千万万万各有差别了。想象一下 ，若是随便撒一把CRISPR/Cas9去编辑十万个细胞的基因 ，假设每个都脱靶 ，且这些脱靶都是随机爆发的 ，那么这十万个细胞最多就会有十万种脱靶 ，每一种脱靶形式只占了所有样本的十万分之一 ，这种微乎其微的异常险些不可能被检测出来。
因此 ，脱靶检测需要依赖所谓的“单细胞测序” ，通俗来说 ，就是实验组和比照组都只有一个细胞。这样的比照虽然就能很容易发明差别 ，可是很显然 ，一个细胞那一丁点DNA是基础不敷拿来检测的。为相识决这个矛盾 ，就要用到“体外扩增”手艺 ，把那一丁点DNA样本复制成千上万份 ，直到数目知足检测所需为止。
可是 ，人类发明的任何体外扩增系统都是不完善的 ，无法做到100%准确拷贝最初的DNA样本 ，每一次复制都会带入一丁点过失。就像复印文稿总比原稿品质差一些一样 ，经由万万次复制再复制 ，就足以让这份DNA样本变得面目一新 ，滋扰检测效果。
这一切引入的“噪音”甚至比脱靶信号自己还要横跨好几个数目级 ，这宛如是在汪洋大海中寻找一滴水一样平常。
一举三得该怎样实现？
找到这滴水的唯一步伐就是让大海（种种滋扰因素）消逝。左二伟博士与导师杨辉还真的想到了一种绝妙的方法 ，同时解决了这三个问题。
为了阻止个体差别 ，我们又需要找到两个基因一模一样的细胞 ，为了凸显脱靶的信号 ，我们又需要用到“单细胞测序” ，然后我们还不可用体外扩增来复制这两个细胞的DNA ，却又需要很大宗的DNA样原来做测序剖析。
首先最容易解决的就是找两个基因完全一模一样的细胞。我们知道 ，大都动物都是从一个受精卵发育而来的 ，这个受精卵一分为二 ，二分为四……等等 ，在它一分为二的时间 ，我们称之为“二细胞期胚胎”阶段 ，不就是两个现成的基因一模一样的细胞吗？
只要向其中一个注射基因编辑工具 ，另一个就是天下上最佳的比照。
其次 ，一个细胞的DNA不是不敷检测么？没关系 ，注射完毕后我们直接把这个二细胞胚胎植入母鼠的子宫当中 ，让它正常发育 ，这样获得的小鼠胚胎中 ，理论上就有一半细胞履历过基因编辑 ，另一半则没有履历过过。
这时间 ，左二伟博士直接将发育长大的小鼠胚胎取出来 ，用一些特殊的酶消化成一大堆疏散的细胞。使用一些要领 ，我们可以追踪其时那两个细胞的子女 ，从这一堆细胞中将它们俩各自的子女分成两拨。由于这两拨细胞也是之前的细胞破碎而来 ，以是它们的基因就相当于是最初谁人细胞的复制品。
这也顺便解决了第三个问题 ，裂解掉这一大堆足以构建出半个小鼠胚胎的巨量细胞 ，一次性就能提取到足够测序剖析的DNA ，从而阻止了体外扩增带来的噪音。
在神经所蒲慕明所长的建议下 ，研究团队将这套系统命名为GOTI�？梢运� ，这套系统的推出 ，标记着人们终于得以用数字来权衡基因编辑的脱靶率。
GOTI的手艺流程：在二细胞期向一个卵裂球注射基因编辑工具 ，并用CRE使之自己以及子女细胞都发出红色荧光。等小鼠胚胎发育到14.5天后取出母体 ，使用流式细胞仪将两个卵裂球的子女脱离 ，并各自所有消化掉提取DNA来做测序剖析。
哪种基因编辑易脱靶？我们挨个测一下
终于到了检测工具一显身手的时间。它接下来要资助人们回覆的要害问题就是：那些常见的基因编辑工具真的会脱靶吗？在GOTI的神威下 ，一切清晰了起来。
首先 ，值得庆幸的是 ，最经典的spCas9系统经受住了磨练。效果显示 ，它引起异�；蛲槐涞目赡苄圆桓哂谛∈笞陨硐赴扑榇吹谋镜谆蛲槐�。就是说 ，从现在的检测效果来看它是清静的。
CRISPR-Cas9系统已经成为现在最利便的基因编辑工具。图片泉源：origene.com
与此同时最令人大跌眼镜的发明是 ，另一类叫做单碱基突变系统（Base Editor）的基因编辑工具有着异常高的脱靶率。所谓的单碱基突变系统 ，大致上可以明确为我们先设计一个只能准确靶向但不会切割DNA的Cas9卵白 ，然后让这个Cas9卵白牵着一个能够通过化学要领将某个碱基定向突变（好比A→T）的酶来给DNA链中引入点突变。
原本这套系统由于不会引入DNA断裂 ，被视为特殊清静的一类基因编辑手艺 ，人们历来不以为它会脱靶 ，之前的脱靶检测也完全没有发明它有任何脱靶的迹象。因此以刘如谦（David Liu）等为代表的一群科学家恒久都在致力于将这项手艺作为基因编辑向临床进军的急先锋。
通过检测发明 ，经典的CRISPR/Cas9并没有显著的脱靶征象 ，可是单碱基编辑系统BE3则泛起了横跨配景基因突变水平数倍的脱靶征象。
这时间研究团队才突然意识到 ，就算Cas9没有在sgRNA向导下跟任何DNA序列团结 ，谁人能够引起碱基定向改变的酶也依旧保存 ，它完全可以像任何在细胞里游离的酶一样 ，让任何无意接触自己的碱基爆发化学反应。这样的系统自然就有高脱靶率的 ，可能之前各人对“没有DNA链断裂就没有脱靶”形成了头脑定势 ，才会忽视这一清静误差。
恒久以来 ，由于缺少令所有人都信服的脱靶检测手艺 ，基因编辑的脱靶问题被吵吵嚷嚷了五年多 ，也让这个领域在此时代一直处于野蛮生长的状态。
现在 ，GOTI泛起了 ，规则还会远吗？
泉源：我是科学家iScientist
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